在低pH值(5)下，贝类分泌含有弱单络合铁(Fe)的儿茶酚黏附溶液；当pH值上升到约8时，单络合物进一步形成双或三配合物，以增强水下附着力。含有组织反应官能团(儿茶酚和醛基)的材料具有较强的组织粘附性。原儿茶醛(PA)是一种天然存在的酚醛，可通过形成可逆的共价键(包括席夫碱键合和儿茶酚-金属离子配位化学)作为键合结构域。PA具有促凋亡和抗菌的特性，并已在临床应用中用于治疗冠心病，有良好的生物相容性。含儿茶酚基团的材料有良好的生物相容性和清除自由基的能力，与铁络合后具有光热灭活细菌的能力，是伤口愈合的理想材料。动态键交联的水凝胶有自主愈合能力和刺激响应特性，有利于控制敷料的去除，避免组织的创伤。壳聚糖的主链上含有丰富的氨基，可以通过适度的交联反应对其进行改性。季铵化壳聚糖(QCS)具有较好的生物相容性、较好的水溶性和较强的杀菌活性。
本文设计了一系列具有良好性能的双动态键交联黏附水凝胶，具有可注射性、自愈性、抗菌性、粘附性、可控去除性和NIR响应性，能够有效促进伤口愈合，并实现伤口愈合后的护理。如图1所示，首先，pH敏感配位键(邻苯二酚-铁)和动态席夫碱键的双交联，具有可逆的断裂和重组，不仅改善了水凝胶的力学性能，而且赋予了水凝胶的可注射性和自愈合性。同时，邻苯二酚-铁交联使基质具有良好的光热性能。结合QCS固有的抗菌活性，该水凝胶作为抗生素的替代品具有广阔的应用前景。此外，动态交联的邻苯二酚和醛基团使水凝胶具有优良的粘附性能。更重要的是，加入铁螯合剂后，邻苯二酚铁-键具有pH敏感性和稳定性，在施加适当的刺激后，可按需溶解或去除胶粘剂水凝胶。
图1水凝胶的制备和应用示意图。(A)季铵盐壳聚糖的合成。GTMAC与壳聚糖主链上氨基的摩尔比为2:1。(B)PA
Fe三复合物分子的制备(pH10.0)。(C)双动态键交联水凝胶在伤口闭合及护理方面的应用。首先，将QCS与PA
Fe通过席夫碱键混合制成双动态键交联水凝胶(图2A)，并制备不同PAFe浓度的水凝胶。以双动态键交联QCSPAFe10水凝胶为例，该水凝胶能够承受压缩(图2B)。由于双动态键交联网络，在应变压缩后保持完整(图2C的插图)。随着氨基与醛的摩尔比从40:1增加到8:1，水凝胶的最大压缩应力从2.2N增加到15.0N，表明水凝胶的交联密度有所提高(图2C)。在流变仪上检测水凝胶随时间的存储模量(G’)和损失模量(G’’)(图2D)，凝胶时确定为G’和G’’的交点。随着PAFe含量的增加，凝胶时间从50min减少到10min,G’值从Pa增加到Pa，表明双动键交联作用可以提高凝胶的力学性能。在图2E中，湿凝胶在PBS中浸泡12h后，氨基和醛的摩尔比为20:1~8:1时，水凝胶的溶胀率(SR)由%降至%，这是由于凝胶的交联密度增加所致。QCS-PAFe40交联密度最低，SR比其他水凝胶样品要低，这可能是由于QCS-PAFe40松散的网络结构更容易被侵蚀。通过扫描电镜观察了水凝胶的形貌，可见所制备的水凝胶具有多孔结构(图2G)。孔径的变化可能归因于网络交联密度的增加，这与存储模量和SR的结果一致。对水凝胶的降解行为进行了评估，选择PBS(pH7.4)作为降解介质，降解率随着交联密度的增加而降低(图2F)。QCS-PAFe40和QCS-PAFe20在不到2周的时间内完全降解，而其他三种水凝胶的降解速度较慢(超过2周)，这是在体内应用的理想选择。图2制备的水凝胶的表征。(A)QCS溶液、PA
Fe溶液、双动键交联水凝胶照片。比例尺:1cm。(B)所制备的水凝胶的原始状态(i)、压缩状态(ii)、恢复状态(iii)。比例尺:1cm。(C)水凝胶在90%应变下的轴向力(插图:水凝胶的原始状态和90%应变时的压缩状态)。比例尺:1cm。(D)凝胶的流变行为。(E)黏附水凝胶(pH7.4,37℃)的溶胀行为。(F)制备的水凝胶在pH7.4,37℃下的体外降解行为。(G)水凝胶的SEM图像。
随后，评估了水凝胶的自愈性和可注射性。随着剪切速率的增加，水凝胶的粘度(QCS-PA
Fe10)降低(图3A)，表明凝胶具有剪切变稀的能力。同时，水凝胶可以通过注射器连续注入，画出字母，当剪切力消除后，水凝胶仍保持稳定的凝胶状态(图3A的插图)。具有自主愈合能力的水凝胶可以延长其使用时间，提高使用安全性。在水凝胶的应变扫描中，当应变低于%时，G’与G’’相交，这是水凝胶网络破坏的临界点(图3B)，当应变超过临界应变时，G’急剧下降。随后，进行连续的交替应变扫描，以确定水凝胶的自主愈合行为(图3C)。当施加高动态应变(%)时，G’的值从Pa下降到88Pa，低于G’’的值，表明凝胶网络受到破坏。当施加较低的应变(1%)时，G’和G’’的值可以在5次交替循环后几乎恢复到原来的值，这表明水凝胶具有自主愈合的行为。通过宏观愈合测试评估凝胶的自主愈合能力(图3D)。将一个圆柱形水凝胶样品切成两半，然后将两半放在一起，置于环境温度下，使水凝胶在没有任何外部干预的情况下恢复。愈合后的样品无裂纹，1h后可以承受自身重量，愈合1h后可以拉伸(应变为%)而在裂纹处不断裂。带有圆形缺陷的QCS-PAFe10水凝胶在室温下放置30min后完全愈合，表明所设计的水凝胶具有良好的愈合能力，这归因于双动键交联水凝胶网络(图3E)。QCS中的氨基与PA中的醛之间的席夫碱动态键，以及PA中的邻苯二酚基团与Fe之间的三络合物配位，使水凝胶具有良好的自愈合性能。图3水凝胶的可注射性和自主愈合性。(A)水凝胶的剪切稀释特性。插图:介绍水凝胶的可注射性。(B)水凝胶的应变扫描，应变范围为0.01%~%(1Hz)。(C)凝胶从1%到%的交替应变的流变行为，循环5次。(D)凝胶宏观愈合能力的照片:原始状态(i)，受损状态(ii)，水凝胶愈合1h((iii)和(iv))，水凝胶愈合2h(v),，具有圆形缺陷的水凝胶的自愈合(vi)。(E)示意图说明凝胶的愈合机制。比例尺:1cm。
然后，评估水凝胶的生物相容性通过溶血检查评价水凝胶的血液相容性，TritonX-为阳性对照组，PBS为阴性对照组。QCS-PA
Fe40、QCS-PAFe20、QCS-PAFe14和QCS-PAFe10水凝胶的定量溶血率随着PAFe含量的增加几乎没有明显变化(小于4%)(图4A)。而QCS-PAFe8凝胶溶血率较高(5.19%)，高于5%的允许上限，说明QCS-PAFe8凝胶的血液相容性较差。活/死细胞检验用于显示细胞的形态，结果表明，L细胞呈纺锤形，大部分呈绿色(活细胞)，只有少数细胞被染成红色(死细胞)，表明制备的水凝胶具有良好的细胞相容性(图4B)。在不同浓度凝胶的浸出液中培养3天，细胞增殖的增加情况如图4C-E所示。第1天，不同浸出样品处理的L细胞的存活率与对照组相比几乎达到%。所有组在接下来的2天培养中均表现出持续的L细胞增殖，在3天培养后，5个样品的细胞活力甚至高于对照组，说明所制备的水凝胶具有良好的细胞相容性。通过苏木精和伊红(HE)染色评估宿主的炎症反应(图4F)。水凝胶植入1周后，各组均出现急性炎症反应，且随着水凝胶降解，炎症细胞和炎症反应逐渐减少。植入4周后样品出现轻度炎症反应，表明水凝胶具有良好的体内相容性。图4水凝胶的生物相容性。(A)水凝胶的溶血行为。(B)L细胞在5mg/mL水凝胶浸出液中孵育24h后的活/死染色结果。不同浓度浸出液孵育1天(C)、2天(D)、在不同浓度的浸出液中孵育1天(C)、2天(D)、3天(E)，L细胞的活力。(F)皮下植入QCS-PA
Fe14、QCS-PAFe10、QCS-PAFe8水凝胶后，HE染色皮肤组织的代表性图像。箭头:水凝胶的位置。接下来，通过表面抗菌活性试验来评估凝胶对革兰氏阴性大肠杆菌、革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和MRSA的抗菌性能(图5A-F)。在37℃下与水凝胶孵育2h后，大部分大肠杆菌(90%)和金黄色葡萄球菌(80%)被灭活，证明了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌优良的抗菌性能。水凝胶处理组与PBS对照组相比，琼脂板上几乎没有菌落(图5A，B)。同时，随着PA
Fe含量的增加，抗菌效果有所提高(图5C)，与QCS-PAFe40、QCS-PAFe20、QCS-PAFe14、QCS-PAFe10、QCS-PAFe8接触2h后，杀灭MRSA的比例分别为67%、81%、89%、94%和98%(图5F)。NIR照射10min后，QCS-PAFe40、QCS-PAFe20、QCS-PAFe14、QCS-PAFe10和QCSPAFe8水凝胶的升温分别为10.1、13.1、13.5、15.2和16.8℃(图5G)，而纯QCS几乎没有升温(1.6℃)。结果表明，纯QCS没有光热效应，邻苯二酚-Fe3+配位交联QCS具有较好的光热性能。红外图像显示交联剂对水凝胶光热容的影响(图5H)，说明PAFe交联水凝胶的光热效应是可控的。在MRSA皮下注射(μL,CFUmL?1)24h后形成皮下脓肿(图5I)，然后将制备好的水凝胶通过注射器注射到感染部位。NIR照射10min后，体表温度增强几乎可以忽略(从~34°C到36.6°C)(图5J)，而水凝胶处理的小鼠体表温度在照射10min后升高到48.9℃，这可以使病原体中的酶变性，杀死细菌。光热治疗后，处死小鼠，取愈合的皮肤匀浆，评价凝胶的抗菌作用。如图5K所示，空白组有无近红外照射干预，水凝胶处理组无近红外照射干预，均未见明显的细菌减少。而近红外照射水凝胶处理组与3个对照组相比，细菌数量明显减少(P0.05)(图5l)。上述结果表明，抗菌水凝胶可作为创面敷料，促进感染皮肤创面愈合。图5水凝胶的抗菌性能。与QCS-PA
Fe40(I)，QCS-PAFe20(II)，QCS-PAFe14(III)，QCS-PAFe10(IV)，QCS-PAFe8(V)接触2小时后琼脂板上的菌落图像:大肠杆菌(A),金黄色葡萄球菌(B)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(C)，定量结果表示水凝胶对大肠杆菌(D),金黄色葡萄球菌(E)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(F)的抗菌性能。(G)近红外照射下水凝胶的温度增强(n=3)。(H)nm照射下水凝胶的红外热图像。(I)皮下注射MRSA24小时后出现皮下脓肿的小鼠照片。比例尺:1cm。(J)未经治疗的皮下脓肿和近红外照射治疗的皮下脓肿的红外热成像，QCSPAFe10水凝胶和QCS-PAFe10近红外照射水凝胶。(K)将菌落呈现在琼脂平板上，(L)不同样品处理后对应的定量结果。近红外辐照功率密度设置为1.4W/cm2。***P0.。接下来，以猪皮为模型生物组织，通过搭接剪切试验(图6A)评价双动键交联水凝胶的黏附性能。随着PA
Fe含量的增加，水凝胶的粘结强度在3~40kpa范围内增加(图6B)。在外力的作用下，胶粘猪皮发生断裂，然后将损伤的水凝胶与切口皮肤合在一起，水凝胶将重新裂开的切口粘合(图6C,D)。愈合1h后的平均粘结强度高于初始粘结强度的60%，表明双动键交联水凝胶具有良好的自愈合性能。在DFO溶液的干预下，考察了QCS-PAFe10水凝胶粘接猪皮后的溶解情况。DFO处理后，水凝胶的粘连强度从10.4kPa急剧下降到1.3kPa(图6E,F)，水凝胶溶解后，可去除敷料而不会对创面造成二次损伤。通过小鼠断尾模型(图6H)和肝脏出血小鼠模型(图6I)评价制备的水凝胶的止血性能。在两种出血模型中，水凝胶治疗组的止血效果较好，几乎未发现明显的血迹(图6H,I的插图)，而未治疗组出现明显的出血。定量分析结果表明，在小鼠断尾模型中，与对照组(mg)相比，胶粘剂水凝胶处理组的失血量显著减少(mg)(P0.05)。在肝出血小鼠模型中，水凝胶有较好的止血效果。空白组未治疗的失血量为mg，而水凝胶治疗组的失血量显著降低至mg(P0.05)。图6QCS-PA
Fe10水凝胶的粘结性能。(A)搭接剪切试验示意图。(B)不同水凝胶在猪皮上的粘结强度。(C)典型力位移曲线和(D)水凝胶粘合猪皮切口损伤前和愈合1小时后的粘合强度(D的插图:原水凝胶和愈合后的水凝胶粘合猪皮的照片)。(E)力位移曲线和(F)水凝胶与猪皮切口结合时，DFO处理与否的结合强度。(G)PAFe复合体溶解的示意图。(H)断尾小鼠模型和(I)肝出血小鼠模型的失血量。*P0.05,**P0.01。然后，用全层皮肤切口模型评估QCS-PA
Fe10水凝胶的创面闭合性能。在大鼠背部做皮肤切口(2cm，全层)；然后用手术缝线、生物医学胶、水凝胶处理切口，并将未处理的创面作为对照(图7A)。用水凝胶处理的切口比外科缝合和生物医学胶有更好的缝合效果。在闭合开始时，未经治疗的切口由于大鼠的移动而变得更大，而用水凝胶治疗的切口保持良好的闭合。虽然切口用生物胶封闭，但切口附近的皮肤显示伤口附近毛发较少，表明皮肤受到了损伤。第10天，切口缝合，胶粘剂水凝胶基本愈合。但未治疗组和生物医用胶治疗组仍存在皮肤切口。愈合3周后，所有切口基本愈合。未治疗或用手术缝合线和生物医学胶缝合的切口愈合后瘢痕明显，而用胶粘剂水凝胶治疗的切口愈合后无瘢痕。为了进一步评估胶粘剂水凝胶的闭合能力，通过拉应变测试来评估愈合皮肤的机械强度(图7B)。结果表明，与其他组相比，水凝胶愈合的皮肤具有更高的抗拉强度。为评估切口愈合情况，在第7天和第21天进一步进行组织学分析。第7天，手术缝合组、生物医用胶治疗组、胶粘剂水凝胶治疗组较对照组切口闭合更好(图7C)。与对照组及手术缝合线缝合切口相比，应用生物医用胶及生物医用胶处理的缝合切口炎症浸润较少，胶原沉积较多，说明应用生物医用胶及生物医用胶处理的切口愈合后护理效果较好。第21天，各皮肤组织胶原纤维均较致密，而水凝胶处理的皮肤组织胶原纤维较其他组胶原纤维沉积更致密，排列更整齐。结果表明，水凝胶能更好地闭合切口，促进愈合后创面的愈合。图7伤口闭合评估水凝胶。(A)经手术缝合线、生物医学胶和粘性水凝胶治疗的皮肤切口，以及在确定时间内未经治疗的皮肤切口的代表性图像。比例尺:1cm。(B)愈合皮肤切口的抗拉强度。(C)皮肤切口愈合7天和21天后HE染色图像和Masson三色染色。*P0.05,**P0.01。
随后，通过MRSA感染的全层皮肤伤口进一步评估了水凝胶的伤口愈合性能。皮肤创面采用QCS-PA
Fe10水凝胶和QCS-PAFe10水凝胶近红外照射处理，单纯QCS和市售敷药处理创面作为对照。如图8AC所示，在愈合3天后，用敷药、纯QCS、水凝胶处理的创面有明显的病原体污染，而用近红外照射水凝胶处理的创面几乎没有病原体污染。近红外水凝胶照射组创面收缩明显大于其他组(P0.05)。四种处理的创面在第7天均出现明显的收缩，且近红外水凝胶处理或不处理创面均比纯QCS和敷药处理的创面收缩更明显(P0.05)。3周后，4组创面几乎完全愈合，但近红外水凝胶照射创面愈合效果优于其他组。采用皮肤组织HE和Masson三色染色从组织学角度评价创面愈合效果。四组皮肤组织在第3天均出现急性炎症反应(图8E)，而NIR辅助抗菌水凝胶处理的皮肤组织炎症浸润较少。结果表明，具有NIR助菌活性的水凝胶的固有抗菌性能协同提高了抗菌效果。第7天，近红外照射水凝胶处理的皮肤组织与其他三组相比炎症细胞浸润较少，成纤维细胞迁移较多。第21天，各组上皮形成完全，无炎症反应。对照组皮肤组织仅再生上皮细胞和真皮的基本结构，其余三组均再生皮肤附件和真皮组织。纯QCS和敷药处理的创面组织中心未形成毛囊，表明愈合不完全，近红外辐射水凝胶处理的再生皮肤组织较其他三组有更多的血管和毛囊。上述结果表明，双交联水凝胶作为抗菌创面敷料的理想材料。图8在体内评价MRSA感染创面愈合水凝胶。(A)用不同样本处理的伤口的代表性照片。比例尺:1cm。(B)市售敷药(b1)、QCS(b2)、QCS-PA
Fe10水凝胶(b3)、QCS-PAFe10近红外照射水凝胶(b4)21天创面收缩示意图。(C)市售敷药第3、7、21天创面收缩，QCS,QCS-PAFe10水凝胶，QCS-PAFe10近红外照射水凝胶。(D)伤口愈合过程示意图。(E)确定时间愈合皮肤组织的HE染色结果。近红外辐照功率密度设置为1.4W/cm2。*P0.05,**P0.01***P0.。最后，通过Masson三色染色评价胶原沉积(图9A)。第21天各组胶原纤维排列整齐，QCS-PA
Fe10水凝胶和近红外照射后皮肤组织胶原纤维更致密、更厚、排列更好，纤维增生和新生血管类似于正常皮肤。上述结果表明，该凝胶对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染皮肤创面有较好的促进创面愈合作用。对愈合的皮肤组织采用CD68免疫荧光染色，评价创面愈合效果。如图9所示，近红外辐射水凝胶修复皮肤组织后第3天CD68表达较其他3组明显减少，水凝胶治疗皮肤创面的炎症反应低于QCS和市售膜，证明了水凝胶的优异抗菌活性。虽然在第7天，四组CD68的表达均轻微下调，但市售膜治疗愈合皮肤组织的炎症反应仍高于QCSPAFe10水凝胶近红外照射治疗皮肤组织(P0.05)(图9)。以上结果表明，具有NIR辅助抗菌能力的水凝胶可有效降低创面愈合初期的炎症反应，而其他组仍处于明显的炎症阶段。此外，通过免疫组化染色检测CD31的表达，以评估愈合效果。第21天，NIR辅助抗菌水凝胶CD31表达量最高(图9D)，水凝胶处理的皮肤创面CD31表达量高于其他两组(P0.05)，表明水凝胶具有更好的促血管能力。具有良好止血效果和抗菌抗氧化能力的粘合水凝胶，可有效促进愈合过程从炎症期到增殖期，加速创面愈合。图9(A)在第7天和第21天，对经市售敷药、QCS、水凝胶、水凝胶近红外照射愈合的皮肤组织进行Masson三色染色。(B)不同处理后CD68(绿色)和CD31(绿色)标记再生皮肤组织的免疫荧光图像。定量分析(C)CD68和(D)CD31染色皮肤组织的相对荧光强度。功率密度设置为1.4W/cm2。*P0.05,**P0.01。
点评：
1.设计并制备了一种具有可注射性、自愈性、良好的生物相容性、优异的抗菌活性、抗氧化能力和按需去除性能的双动键交联水凝胶，可有效闭合创面，加速MRSA感染的全层皮肤创面愈合。
2.双动态键交联网络赋予水凝胶良好的机械强度和组织黏附性，以及良好的自愈合能力。不仅能有效封闭皮肤切口，还能在DFO或酸溶液的干预下实现按需去除。QCS固有的抗菌特性和NIR辅助的光热消除协同提高了水凝胶的抗菌效率。
3.具有上述良好性能的水凝胶，可有效闭合皮肤切口，实现创面愈合后的护理，在MRSA感染的全层皮肤创面愈合方面表现出积极的效果，具有作为创面敷料的巨大潜力。
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